VECTORES VIRALES

VIRUS

Todos los virus son capaces de introducir su material genético en la célula huésped como parte de su ciclo de replicación. Gracias a ello, pueden producir más copias de sí mismos, e infectar a otras células.

Algunos tipos de virus insertan sus genes físicamente en el genoma del huésped, otros pasan por varios orgánulos celulares en su ciclo de infección y otros se replican directamente en el citoplasma, por lo que en función de la terapia a realizar nos puede interesar uno u otro.

Algo común a la mayoría de estrategias con virus es la necesidad de usar líneas celulares "empaquetadoras" o virus helpers, que porten los genes que les eliminamos a nuestros vectores y que permiten la infección.

RETROVIRUS

El genoma de los retrovirus está constituido por ARN de cadena sencilla, en el cual se distinguen tres zonas claramente definidas: una intermedia con genes estructurales, y dos flanqueantes con genes y estructuras reguladoras. Cuando un retrovirus infecta a una célula huésped, introduce su ARN junto con algunas enzimas que se encuentran en la matriz, concretamente una proteasa, una transcriptasa inversa y una integrasa.
La acción de la retrotranscriptasa permite la síntesis del ADN genómico del virus a partir del ARN. A continuación, la integrasa introduce este ADN en el genoma del huésped. A partir de este punto, el virus puede permanecer latente o puede activar la replicación masivamente.
Para usar los retrovirus como vectores víricos para terapia génica inicialmente se eliminaron los genes responsables de su replicación y se reemplazaron estas regiones por el gen a introducir seguido de un gen marcador.
Del genoma vírico quedaban las secuencias LTR; y los elementos necesarios para producir los vectores a gran escala y para transformar las células son aportados desdes otros vectores, bien plasmídicos o bien en líneas celulares específicas. En el caso de usar vectores plasmídicos, estrategias como cotransformar con varios plásmidos distintos que codifiquen para las proteínas del retrovirus, y que la transcripción de sus secuencias esté sometida a promotores eucariotas puede contribuir a minimizar el riesgo de que por recombinación se generen virus recombinantes.^[1]
Actualmente se buscan estrategias como la anterior para conseguir una mayor seguridad en el proceso. La adición de colas de poliadenina al transgén para evitar la transcripción de la segunda secuencia LTR es un ejemplo de esto^{[cita requerida]}.
Los retrovirus como vector en terapia génica presentan un inconveniente considerable, y es que la enzima integrasa puede insertar el material genético en cualquier zona del genoma del huésped, pudiendo causar efectos deletéreos como la modificación en el patrón de la expresión (efecto posicional) o la mutagénesis de un gen silvestre por inserción.

Ensayos de terapia génica utilizando vectores retrovirales para tratar la inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X (X-SCID) representan la aplicación más exitosa de la terapia hasta la fecha. Así, más de veinte pacientes han sido tratado en Francia y Gran Bretaña, con una alta tasa de reconstitución del sistema inmunitario. Sin embargo, ensayos similares fueron restringidos en los Estados Unidos cuando se informó de la aparición de leucemia en pacientes.^{[cita requerida]} Hasta hoy se conocen cuatro casos de niños franceses y uno británico que han desarrollado leucemia como resultado de mutagénesis por inserción de los vectores retrovirales, y todos menos uno de estos niños respondieron bien al tratamiento convencional contra la leucemia. ^{[cita requerida]} En la actualidad, la terapia génica para tratar SCID continúa siendo exitosa en Estados Unidos, Gran Bretaña, Italia y Japón

ADENOVIRUS

Los adenovirus presentan un genoma de DNA bicatenario, y no integran su genoma cuando infectan a la célula huésped, sino que la molécula de ADN permanece libre en el núcleo celular y se transcribe de forma independiente. Esto supone que el efecto posicional o la mutagénesis por inserción no se dan en estos vectores, lo cual no quiere decir que no tengan otros inconvenientes. Además, debido al hecho de que en su ciclo natural se introducen en el núcleo de la célula, pueden infectar tanto células en división como células quiescentes.

A los vectores de primera generación se les eliminó parte del gen E1, básica para la replicación, y a los de 2ª, se les eliminaron otros genes tempranos en el ciclo del virus. En ambos casos, cuando se realiza una infección con una concentración elevada de virus, se produce la expresión de otros genes que provocan una respuesta inmune considerable.

Por ello, los últimos vectores basados en adenovirus prácticamente han sido desprovistos de la mayor parte de sus genes, con la excepción de las regiones ITR (regiones repetidas de forma invertida), y la zona necesaria para la encapsidación.

VIRUS ADENOASICIADOS(AAV)

Los AAV son virus pequeños con un genoma de ADN monocatenario. Pueden integrarse específicamente en el cromosoma 19 con una alta probabilidad. Sin embargo, el VAA recombinante que se usa como vector y que no contiene ningún gen viral, solo el gen terapéutico, no se integra en el genoma. En su lugar, el genoma vírico recombinante fusiona sus extremos a través del ITR (repeticiones terminales invertidas), apareciendo recombinación de la forma circular y episomal que se predice que pueden ser la causa de la expresión génica a largo plazo.
Las desventajes de los sistemas basados en AAV radican principalmente en la limitación del tamaño de DNA recombinante que podemos usar, que es muy poco, dado el tamaño del virus. También el proceso de producción e infección resultan bastante complejos. No obstante, como se trata de un virus no patógeno en la mayoría de los pacientes tratados no aparecen respuestas inmunes para eliminar el virus ni las células con las que han sido tratados.
Muchos ensayos con VAA están en curso o en preparación, principalmente en el tratamiento de músculos y enfermedades oculares, los dos tejidos donde el virus parece ser particularmente útil^{[cita requerida]}. Sin embargo, se están comenzando a realizar pruebas clínicas, donde vectores basados en el VAA son utilizados para introducir los genes en el cerebro^{[cita requerida]}. Esto es posible porque VAA pueden infectar células que no están en estado de división, tales como las neuronas.

HERPES VIRUS
Los herpesvirus son virus de ADN capaces de establecer latencia en sus células huésped. Son complejos genéticamente hablando, pero para su uso como vectores tienen la ventaja de poder incorporar fragmentos de DNA exógeno de gran tamaño (hasta unas 30 kb). Además, aunque su ciclo lítico lo realizan en el lugar de infección, establecen la latencia en neuronas, las cuales están implicadas en numerosas enfermedades del sistema nervioso, y son por ello dianas de gran interés.
Los vectores herpesvíricos puestos en marcha han usado dos estrategias principales:
- La recombinación homóloga entre el genoma del virus completo y el contenido en un plásmido que llevaba el transgén en la zona que codifica para genes no esenciales en lo que se refiere a replicación e infección.
- El uso de vectores con orígenes de replicación del virus así como las correspondientes secuencias de empaquetamiento, y su introducción en estirpes celulares bien coinfectadas con virus silvestres o bien portadoras del resto de genes del mismo implicados en la encapsidación y replicación, para permitir la formación de partículas virales recombinantes con las que realizar el tratamiento.
No obstante, el uso de vectores basados en el HSV (herpes simplex virus humano), sólo puede llevarse a cabo en pacientes que no hayan sido infectados previamente por él, pues pueden presentar inmunidad.