EXPERIMENTOS

Experimentos en animales

Los experimentos con animales conforman una parte fundamental en el estudio de cualquiera de las aplicaciones de terapia génica; sus dos objetivos principales son el análisis de la seguridad del sistema de vectores y el estudio de la eficacia de la transferencia de genes. El efecto de la dosis y su duración es comprobado en varias especies, incluyendo primates y otros animales que sean hospedadores para el virus salvaje (por ejemplo, las ratas del algodón se usan para el estudio de adenovirus). Se analiza la difusión de secuencias vitales, especialmente a las gónadas, y cualquier efecto adverso, como la inflamación tras la administración del vector. El propósito de estos ensayos no es mostrar que el vector no produce efectos adversos —cualquier clase de droga tiene esa capacidad en determinada dosis—, sino precisar el tipo de suceso adverso que podría esperarse si los humanos estuvieran expuestos al vector, y fijar las posibles dosis que pueden acarrear estos sucesos. Para una enfermedad genética, un ratón con un gen eliminado o un animal con el fenotipo apropiado sería válido en este tipo de estudio.

Terapia génica en seres humanos

Esta terapia está destinada al tratamiento de enfermedades infecciosas y auto inmunes, Las estrategias se basan en la eliminación de poblaciones de células infectadas con virus, como el HIV, mediante administración directa de moléculas de ácidos nucleicos o a través del desarrollo de vacunas. En la terapia contra el cáncer, se puede actuar con diferentes objetivos. Si se opera sobre las células del sistema inmunitario, se manipulan ex vivo las células efectoras antitumorales del sistema inmune. Estas células son modificadas genéticamente y reimplantadas con el fin de liberar dentro del tumor el producto de los genes exógenos, como las cítoquinas. Sobre las células hematopeyéticas o formadoras de sangre se actúa incorporando los llamados genes MDR, que confieren mayor resistencia a las altas aplicaciones de quimioterapia en el paciente. Si se actúa directamente sobre las células tumorales, se introducen factores genéticos que provoquen la muerte o apoptosis de las células tumorales o aumenten la respuesta del sistema inmunitario antitumoral del paciente.

STOP: SERES HUMANOS

El primer objetivo de la identificación y clonación de genes responsables de enfermedades de origen genético es el diagnóstico precoz, prenatal o postnatal. Pero diagnósticos eficaces sin terapia posible satisfacen poco a los afectados. La identificación de genes humanos mediante técnicas de ingeniería genética constituye, no obstante, el primer paso para desentrañar las bases moleculares y fisiopatológicas de una enfermedad. Conocidas éstas, las estrategias de investigación pueden ir en dos direcciones:

1.-	Vía farmacológica, para intentar compensar las consecuencias fisiológicas del disfuncionamiento celular;
2.-	Vía genética, buscando la introducción de un gen foráneo -el transgén- en las células afectadas, para que sustituya al gen anómalo. Este enfoque es el que corresponde a la terapia génica.

Desde los primeros intentos (no autorizados) de terapia génica por Martin Cline en 1979-1980 hasta hoy. Lo ideal sería colocarlo dentro de uno de los cromosomas de la célula diana, en sustitución del gen anómalo. Pero, de momento, el recurso a la técnica más eficaz está vedada en humanos. La recombinación homóloga se ha mostrado operativa en ratón, permitiendo una modificación estable y definitiva de las células embrionarias germinales, transmisible a la descendencia. Pero esta posibilidad en el hombre es rechazada unánimemente por todos los comités internacionales de bioética. Sólo queda el recurso a la adición génica: el gen defectuoso sigue presente en el cromosoma, y el transgén introducido puede permanecer fuera del núcleo o de los cromosomas en forma de ADN no cromosómico (episoma).

Otra alternativa sería la introducción al azar del transgén en el genoma, con el riesgo de alterar la función de algún gen esencial. Las precauciones frente a estas estrategias tan imprecisas consisten en impedir la propagación y transmisión del sistema de transferencia del gen (el vector) y comprobar si la inserción del gen foráneo no conlleva la inactivación de algún gen del hospedador o la activación de algún proto-oncogén.

TERAPIA GENICA EN LOS ANIMALES Y LA CULTURA POPULAR

• El primer ejemplo de terapia génica en mamíferos fue la corrección de la deficiencia en la producción de la hormona del crecimiento en ratones.^{[cita requerida]} La mutación recesiva little (lit) produce ratones enanos. A pesar de que estos presentan un gen de la hormona del crecimiento aparentemente normal, no producen mARN a partir de este gen.
• El primer paso en la corrección del defecto consistió en la inyección de cinco mil copias de un fragmento de ADN lineal portador de la región estructural del gen de la hormona del crecimiento de la rata fusionado al promotor del gen de la metalotioneína de ratón, en huevos lit. La función normal de la metalotioneína es la destoxificación de los metales pesados, por lo que la región reguladora responde a la presencia de metales pesados en el animal. Los huevos inyectados fueron implantados en hembras. El 1% de los ratones de la descendencia resultaron ser transgénicos, y alcanzaron mayor tamaño.
• Se ha creado una tecnología similar para generar variedades transgénicas de salmón del Pacífico con una tasa rápida de crecimiento y, los resultados han sido espectaculares.^{[cita requerida]} Se microinyectó en huevos de salmón un plásmido portador del gen de la hormona del crecimiento regulado por el promotor de la metalotioneína y una pequeña porción de peces resultantes fueron transgénicos, pesando once veces más que los no transgénicos.

• En series de televisión como Dark Angel, el tema de la terapia génica se menciona como una de las prácticas realizadas en niños transgénicos y sus madres. También en la serie Alias, aparece la terapia génica molecular como explicación a dos individuos idénticos.

• Es un un elemento fundamental en la trama de videojuegos como Bioshock o Metal Gear Solid, y desempeña un papel importante en la trama de películas como Muere otro día, de James Bond o Soy leyenda, deWill Smith, entre otras muchas.

LIMITACIONES Y AVANCES

El principal obstáculo que afronta la terapia génica es la imposibilidad técnica de introducir el material genético en el mismo sitio donde están los genes anómalos. La mayoría de vectores deja los nuevos genes extracromosómicos por lo que el efecto se pierde rápidamente por digestión del DNA o por que en las mitosis sucesivas el nuevo material no se incorpora a los cromosomas. La farmacocinética de los vectores virales o no virales es un elemento importante para un adecuado tratamiento y hasta ahora se han empezado ha hacer las primeras consideraciones sobre la mejor manera de abordar el problema. En la mayoría de trabajos realizados hasta ahora, la limitación principal es el corto tiempo de expresión de la proteína nueva. Por múltiples razones la célula termina evitando la trascripción y traducción del gen modificado y el efecto terapéutico desaparece. Otros efectos secundarios que se han visto son la reacción inmune contra el nuevo producto o la activación de otros sistemas génicos que por ignorancia en la fisiología de la genética es imposible prever su disregulación.

PROBLEMAS DE LA TERAPIA GÉNICA Y DE SUS APLICACIONES

Un concepto muy importante del que radican algunos aspectos de la seguridad de la terapia génica es el de la barrera Weismann. Se refiere al hecho de que la información hereditaria sólo va de células germinales a células somáticas, y no al revés.

La terapia génica en células germinales es mucho más controvertida que en células somáticas, pero aún así, si la barrera Weismann fuera permeable a algún intercambio de información, como algunos autores señalan,¹⁹ incluso la terapia en células somáticas podría tener problemas éticos y de seguridad que antes no habrían sido considerados.

La naturaleza de la propia terapia génica y sus vectores, implica que en muchas ocasiones los pacientes deben repetir la terapia cada cierto tiempo porque ésta no es estable y su expresión es temporal.

La respuesta inmune del organismo ante un agente extraño como un virus o una secuencia de DNA exógena. Además, esta respuesta se refuerza en las sucesivas aplicaciones de un mismo agente.

Problemas relacionados los vectores virales. Podrían contaminarse tanto por sustancias químicas como por virus con capacidad de generar la enfermedad. Implican también riesgos de respuesta inmune

Trastornos multigénicos: representan un reto muy grande para este tipo de terapia, ya que se trata de enfermedades cuyo origen reside en mutaciones en varios genes, y aplicar el tratamiento se encontraría con las dificultades clásicas de la terapia multiplicadas por el número de genes a tratar.

Posibilidad de inducir un tumor por mutagénesis. Esto puede ocurrir si el ADN se integra por ejemplo en un gen supresor tumoral. Se ha dado este caso en los ensayos clínicos para SCID ligada al cromosoma X, en los cuales 3 de 20 pacientes desarrollaron leucemia.

En el momento actual se han descrito en la literatura 425 protocolos para realizar terapia génica en humanos y se han intervenido más de 3.400 pacientes en el mundo. El 70% de las terapias realizadas han sido para intervenir procesos neoplásicos, un 12 % sobre enfermedades infecciosas y un 9% sobre patologías unigénicas. Los métodos más utilizados como vectores son el retrovirus, los liposomas y los adenovirus.

PORCENTAJES DE ENSAYOS EN LA ACTUALIDAD

EXPERIENCIAS

PRINCIPALES ACONTECIMIENTOS EN EL DESARROLLO DE LA TERAPIA GENICA

2002 y anteriores

En 1990, W. French Anderson propone el uso de células de médula ósea tratadas con un vector retroviral que porta una copia correcta del gen que codifica para la enzima adenosina desaminasa,² la cual se encuentra mutada en una enfermedad que forma parte del grupo de las inmunodeficiencias severas combinadas (SCID). Realizó la transformación ex-vivo con los linfocitos T del paciente, que luego se volvieron a introducir en su cuerpo. Cinco años más tarde, publicaron los resultados de la terapia,³ que contribuyó a que la comunidad científica y la sociedad consideraran las posibilidades de ésta técnica.

No obstante, el apoyo a la terapia fue cuestionado cuando algunos niños tratados para SCID desarrollaron leucemia.⁴ Las pruebas clínicas se interrumpieron temporalmente en el 2002, a causa del impacto que suposo el caso de Jesse Gelsinger, la primera persona reconocida públicamente como fallecida a causa de la terapia génica. Existe una bibliografía numerosa sobre el tema, y es destacable el informe que la FDAemitió señalando el conflicto de intereses de algunos de los médicos implicados en el caso así como los fallos en el procedimiento. En el año 2002, cuatro ensayos en marcha de terapia génica se paralizaron al desarrollarse en un niño tratado una enfermedad similar a la leucemia.⁵ Posteriormente, tras una revisión de los procedimientos, se reanudaron los proyectos en marcha.

[editar]2003

Un equipo de investigadores de la universidad de California, en Los Ángeles, insertó genes en un cerebro utilizando liposomas recubiertos de un polímero llamado polietilen glicol (PEG).⁶ La transferencia de genes en este órgano es un logro significativo porque los vectores virales son demasiado grandes para cruzar la “barrera hematoencefálica”. Este método tiene el potencial para el tratamiento de la enfermedad delParkinson.

También la interferencia por ARN se planteó en éste año para tratar la enfermedad de Huntington.⁷

[editar]2006

Científicos del NIH tratan exitosamente un melanoma metastásico en dos pacientes, utilizando células T para atacar a las células cancerosas. Este estudio constituye la primera demostración de que la terapia génica puede ser efectivamente un tratamiento contra el cáncer.⁸

En Marzo del 2006, un grupo internacional de científicos anunció el uso exitoso de la terapia génica para el tratamiento de dos pacientes adultos contagiados por una enfermedad que afecta a las célulasmieloides. El estudio,⁹ publicado en Nature Medicine, es pionero en mostrar que la terapia génica puede curar enfermedades del sistema mieloide.

En Mayo del 2006, un equipo de científicos dirigidos por el Dr. Luigi Naldini y el Dr. Brian Brown del Instituto de San Raffaele Telethon para la Terapia Génica (HSR-TIGET) en Milán, informaron del desarrollo de una forma de prevenir que el sistema inmune pueda rechazar la entrada de genes.¹⁰ Los investigadores del Dr. Naldini observaron que se podía utilizar la función natural de los microRNA para desactivar selectivamente los genes terapéuticos en las células del sistema inmunológico. Este trabajo tiene implicaciones importantes para el tratamiento de la hemofilia y otras enfermedades genéticas.

En Noviembre del mismo año, Preston Nix de la Universidad de Pensilvania informó sobre VRX496,¹¹ una inmunoterapia para el tratamiento del HIV que utiliza un vector lentiviral para transportar un DNA antisentido contra la envuelta del HIV. Fue la primera terapia con un vector lentiviral aprobada por la FDA para ensayos clínicos. Los datos de la fase I/II ya están disponibles.¹²

[editar]2007

El 1 de mayo del 2007, el hospital Moorfields Eye y la universidad College London´s Institute of Ophthalmology anunciaron el primer ensayo de terapia génica para la enfermedad hereditaria de retina. La primera operación se llevó a cabo en un varón británico de 23 años de edad, Robert Johnson, a principios de este año.¹³ La Amaurosis congénita de Leber es una enfermedad hereditaria que causa la ceguera por mutaciones en el gen RPE65. Los resultados de la Moorfields/UCL se publicaron en New England Journal of Medicine. Se investigó la transfección subretiniana por el virus recombinante adeno-asociado llevando el gen RPE65, y se encontraron resultados positivos. Los pacientes mostraron cierto incremento de la visión, y no se presentaron efectos secundarios aparentes.¹⁴ Los ensayos clínicos de esta terapia se encuentran en fase I.¹⁵

[editar]2008

Investigadores de la Universidad de Míchigan en Ann Arbor (Estados Unidos) desarrollaron una terapia genética que ralentiza y recupera las encías ante el avance de la enfermedad periodontal, la principal causa de pérdida de dientes en adultos.¹⁶ Los investigadores descubrieron una forma de ayudar a ciertas células utilizando un virus inactivado para producir más cantidad de una proteína denominada receptor TNF. Este factor se encuentra en bajas cantidades en los pacientes con periodontitis. La proteína administrada permite disminuir los niveles excesivos de TNF, un compuesto que empeora la destrucción ósea inflamatoria en pacientes que sufren de artritis, deterioro articular y periodontitis. Los resultados del trabajo mostraron que entre el 60 y el 80 por ciento de los tejidos periodontales se libraban de la destrucción al utilizar la terapia génica^{[cita requerida]}.

[editar]2009

En Septiembre de 2009, se publicó en Nature que unos investigadores de la Universidad de Washington y la Universidad de Florida fueron capaces de proporcionar visión tricromática a monos ardilla usando terapia génica.¹⁷

En noviembre de ese mismo año, la revista Science publicó resultados alentadores sobre el uso de terapia génica en una enfermedad muy grave del cerebro, la adrenoleucodistrofia, usando un vector retroviral para el tratamiento.¹⁸

USOS

HISTORIA Y METODOLOGIA

Desde el descubrimiento de las enzimas de restricción en el año de 1.970 por Arber y Hamilton se sentaron las bases para transferir genes entre diferentes células u organismos, inclusive pertenecientes a diferentes especies. En 1.978 se realizó la primera hormona recombinante insertando el gen de la insulina en una bacteria E. coli. De allí en adelante se afianzaron los conocimientos necesarios para transferir genes a células humanas con el fin de alterar el fenotipo patológico y generar una nueva forma terapéutica. La primera transferencia se realizó en el año de 1.989 en un paciente con una inmunodeficiencia. Aunque no se encontraron efectos clínicos se explicitó que tampoco había efectos deletéreos como muchos apocalípticamente habían pronosticado. En 1.990 se trató con terapia génica un paciente que padecía de la deficiencia de la enzima adenosina-deaminasa presentando infecciones bacterianas a repetición. Aunque la mejoría fue temporal, con este ensayo se comprobó que la terapia génica tenía posibilidades terapéuticas reales.

Consideraciones generales

La terapia génica es un método que puede ser usado para el manejo de trastornos hereditarios, así como de enfermedades adquiridas. En las de origen puramente genético están todas las alteraciones unigénicas, principalmente las que presentan un mecanismo de herencia recesivo, en donde se ha demostrado la relación  entre un gen y una proteína. Las patologías adquiridas como neoplasias o enfermedades infecciosas tienen un abordaje curativo y otro preventivo, ya que si pudiéramos cambiar la susceptibilidad genética de un individuo a una cierta patología podríamos prevenir la aparición de ese fenotipo y estaríamos “vacunando” a las personas contra padecimientos multifactoriales.

Metodología

Para introducir un gen en una célula eucariote se utilizan vectores que transportan normalmente material genético a las células como virus o fagos. El DNA o RNA de estos organismos es cortado con enzimas de restricción con el fin de quitar las regiones patógenas e insertar en estas zonas de su genoma el gen de interés médico. Una vez recombinado el genoma del vector con el nuevo material genético, este se ensambla de forma fisiológica y se le deja “infectar” o trasnfectar la célula blanco. El vector, al realizar sus procesos de incorporación al genoma humano y a sus mecanismos de trascripción y traducción de proteínas terminará finalmente generando cantidades importantes de la proteína normal que seguramente va a tener efectos terapéuticos en el paciente.

METODOS HIBRIDOS NO VIRALES

Debido a las deficiencias de muchos de los sistemas de transferencia génica se han desarrollado algunos métodos híbridos que combinan dos o más técnicas. Los virosomas son un ejemplo, y combinan liposomas con el virus inactivado VIH o el virus de la gripe. Éstos han demostrado una eficacia de transfección en células epiteliales del sistema respiratorio mayorque cualquier otro método vírico o liposomal ^{[cita requerida]}.
Otros métodos implicados mezclan vectores víricos con lípidos catiónicos o virus híbridos.

DENDIMETROS:Un dendrímero es una macromolécula muy ramificada con forma esférica. Su superficie puede ser funcional de muchas formas y de ésta derivan muchas de sus propiedades.
En particular, es posible construir un dendrímero catiónico, es decir, con carga superficial positiva. De esta forma, interacciona con el ácido nucléico, cargado negativamente, y forma un complejo que puede entrar por endocitosis en la célula.
Los costes de producción son elevados, pero se están desarrollando técnicas que permiten abaratarlo, puesto que se trata de una técnica con una toxicidad muy baja, y su principal desventaja es a nivel productivo.

METODOS NO VIRALES

Estos métodos presentan ciertas ventajas sobre los métodos virales, tales como facilidades de producción a gran escala y baja inmunogenicidad. Anteriormente, los bajos niveles de transfección y expresión del gen mantenían a los métodos no virales en una situación menos ventajosa; sin embargo, los recientes avances en la tecnología de vectores han producido moléculas y técnicas de transfección con eficiencias similares a las de los virus.

ADN DESNUDO

Éste es el método más simple de la transfección no viral. Consiste en la inyección intramuscular de, por ejemplo, un plásmido con ADN desnudo. Varios de estos ensayos dieron resultados exitosos^{[cita requerida]}. Sin embargo, la expresión ha sido muy baja en comparación con otros métodos de transformación. Además de los ensayos con plásmidos, se han realizado ensayos con productos de PCR, y se ha obtenido un éxito similar o superior. Este logro, sin embargo, no supera a otros métodos, lo que ha llevado a una investigación con métodos más eficientes de transformación, tales como la electroporación, la sonicación, o el uso de la biobalística, que consiste en disparar partículas de oro recubiertas de ADN hacia la célula utilizando altas presiones de gas.

 Oligonucleótidos

El uso de oligonucleótidos sintéticos en la terapia génica tiene como objetivo la inactivación de los genes implicados en el proceso de la enfermedad.
Existen varias estrategias para el tratamiento con oligonucleótidos
Una estrategia, la terapia "antisentido" utiliza oligonucleótidos con la secuencia complementaria al RNAm del gen diana, lo que activa un mecanismo de silenciamiento génico. También se puede usar para alterar la transcripción del gen defectuoso, modificando por ejemplo su patrón de edición de intrones y exones.
También se hace uso de moléculas pequeñas de RNAi para activar un mecanismo de silenciamiento génico similar al de la terapia antisentido
Otra posibilidad es utilizar oligodesoxinucleótidos como un señuelo para los factores que se requieren en la activación de la transcripción de los genes diana. Los factores de transcripción se unen a los señuelos en lugar de al promotor del gen defectuoso, lo que reduce expresión de los genes diana. Además, oligonucleótidos de ADN monocatenario han sido utilizados para dirigir el cambio de un única base dentro de la secuencia de un gen mutante.
Al igual que los métodos de ADN desnudo, requieren de técnicas de transformación para introducirse en la célula.

Lipoplexes y poliplexes

El vector de ADN puede ser cubierto por lípidos formando una estructura organizada, como una micela o un liposoma. Cuando la estructura organizada forma un complejo con el ADN entonces se denomina lipoplexe.
Hay tres tipos de lípidos: aniónicos, neutros, o catiónicos. Inicialmente, lípidos aniónicos y neutros eran utilizados en la construcción de lipoplexes para vectores sintéticos. Sin embargo, estos son relativamente tóxicos, incompatibles con fluidos corporales y presentan la posibilidad de adaptarse a permanecer en un tejido específico. Además, son complejos y requieren tiempo para producirlos, por lo que la atención se dirigió a las versiones catiónicas. Éstos, debido a su carga positiva, interaccionan con el ADN, que presenta carga negativa, de tal forma que facilita la encapsulación del ADN en liposomas. Más tarde, se constató que el uso de lípidos catiónicos mejoraba la estabilidad de los lipoplexes. Además, como resultado de su carga, los liposomas catiónicos interactúan también con la membrana celular, y se cree que la endocitosis es la principal vía por la que las células absorben los lipoplexes.
Los endosomas se forman como resultado de la endocitosis. Sin embargo, si los genes no pueden liberarse al citoplasma por rotura de la membrana del endosoma, los liposomas y el ADN contenido serán destruidos. La eficiencia de ese "escape endosomal" en el caso de liposomas constituidos solo por lípidos catiónicos es baja. Sin embargo, cuando “lípidos de ayuda” (normalmente lípidos electroneutrales, tales como DOPE) son añadidos, la eficacia es bastante mayor. Además, ciertos lípidos (lípidos fusogénicos) tienen la capacidad de desestabilizar la membrana del endosoma.
No obstante, los lípidos catiónicos presentan efectos tóxicos dependientes de dosis, lo que limita la cantidad que de ellos se puede usar y por tanto la terapia en sí.
El uso más común de los lipoplexes es la transferencia de genes en células cancerosas, donde los genes suministrados activan genes supresores del tumor en la célula y disminuyen la actividad de los oncogenes.
Estudios recientes han mostrado que lipoplexes son útiles en las células epiteliales del sistema respiratorio ^{[cita requerida]}, por lo que pueden ser utilizados para el tratamiento genético de las enfermedades respiratorias como la fibrosis quística.
Los complejos de polímeros de ADN se denominan poliplexes y la mayoría consisten en polímeros catiónicos, regulados por interacciones iónicas.

Una gran diferencia entre los métodos de acción de poliplexes y lipoplexes es que algunos poliplexes no pueden liberar su ADN cargado al citoplasma, por lo que requieren de la contransfección con agentes que contribuyan a la liss del endosoma. Existen otros elementos formadores de poliplexes, como el quitosano o la polietilamina, que si son capaces de liberarse del endosoma.

PROTEINA "pseudotyping" DE VECTORES VIRALES!!!!!

Los vectores virales descritos anteriormente tienen poblaciones naturales de células huésped que ellos infectan de manera eficiente. Sin embargo, algunos tipos celulares no son sensibles a la infección por estos virus.

La entrada del virus a la célula está mediada por proteínas de su superficie externa (que pueden formar parte de una cápside o de una membrana). Estas proteínas interaccionan con receptores celulares que pueden inducir cambios estructurales en el virus y contribuir a su entrada en la célula por endocitosis.

En cualquier caso, la entrada en las células huésped requiere una interacción favorable entre una proteína de la superficie del virus, y una proteína de la superficie de la célula. Según la finalidad de una determinada terapia génica, se podría limitar o expandir el rango de células susceptibles a la infección por un vector. Por ello, se han desarrollado vectores conocidos como "pseudotyped", en los cuales la cubierta vírica de proteínas silvestre ha sido remplazada por péptidos de otros virus, o por proteínas quiméricas, que constan de las partes de la proteína vírica necesarias para su incorporación en el virión, así como las secuencias que supuestamente a interaccionar con receptores específicos de proteínas celulares.

Por ejemplo, el vector retrovírico más popular para el uso en pruebas de terapia génica ha sido el virus de la inmunodeficiencia en simios revestido con la cubierta de proteínas G del virus de la estomatitis vesicular. Este vector se conoce como VSV y puede infectar a casi todas las células, gracias a la proteína G con la cual este vector es revestido^{[cita requerida]}.

Se ha intentado en numerosas ocasiones limitar el tropismo (capacidad de infectar a muchas células) de los vectores virales.Este avance podría permitir la administración sistemática de una cantidad relativamente pequeña del vector. La mayoría de los intentos han utilizado proteínas quiméricas para la envuelta^{[cita requerida]}, las cuales incluían fragmentos de anticuerpos.

VECTORES VIRALES

VIRUS

Todos los virus son capaces de introducir su material genético en la célula huésped como parte de su ciclo de replicación. Gracias a ello, pueden producir más copias de sí mismos, e infectar a otras células.

Algunos tipos de virus insertan sus genes físicamente en el genoma del huésped, otros pasan por varios orgánulos celulares en su ciclo de infección y otros se replican directamente en el citoplasma, por lo que en función de la terapia a realizar nos puede interesar uno u otro.

Algo común a la mayoría de estrategias con virus es la necesidad de usar líneas celulares "empaquetadoras" o virus helpers, que porten los genes que les eliminamos a nuestros vectores y que permiten la infección.

RETROVIRUS

El genoma de los retrovirus está constituido por ARN de cadena sencilla, en el cual se distinguen tres zonas claramente definidas: una intermedia con genes estructurales, y dos flanqueantes con genes y estructuras reguladoras. Cuando un retrovirus infecta a una célula huésped, introduce su ARN junto con algunas enzimas que se encuentran en la matriz, concretamente una proteasa, una transcriptasa inversa y una integrasa.
La acción de la retrotranscriptasa permite la síntesis del ADN genómico del virus a partir del ARN. A continuación, la integrasa introduce este ADN en el genoma del huésped. A partir de este punto, el virus puede permanecer latente o puede activar la replicación masivamente.
Para usar los retrovirus como vectores víricos para terapia génica inicialmente se eliminaron los genes responsables de su replicación y se reemplazaron estas regiones por el gen a introducir seguido de un gen marcador.
Del genoma vírico quedaban las secuencias LTR; y los elementos necesarios para producir los vectores a gran escala y para transformar las células son aportados desdes otros vectores, bien plasmídicos o bien en líneas celulares específicas. En el caso de usar vectores plasmídicos, estrategias como cotransformar con varios plásmidos distintos que codifiquen para las proteínas del retrovirus, y que la transcripción de sus secuencias esté sometida a promotores eucariotas puede contribuir a minimizar el riesgo de que por recombinación se generen virus recombinantes.^[1]
Actualmente se buscan estrategias como la anterior para conseguir una mayor seguridad en el proceso. La adición de colas de poliadenina al transgén para evitar la transcripción de la segunda secuencia LTR es un ejemplo de esto^{[cita requerida]}.
Los retrovirus como vector en terapia génica presentan un inconveniente considerable, y es que la enzima integrasa puede insertar el material genético en cualquier zona del genoma del huésped, pudiendo causar efectos deletéreos como la modificación en el patrón de la expresión (efecto posicional) o la mutagénesis de un gen silvestre por inserción.

Ensayos de terapia génica utilizando vectores retrovirales para tratar la inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X (X-SCID) representan la aplicación más exitosa de la terapia hasta la fecha. Así, más de veinte pacientes han sido tratado en Francia y Gran Bretaña, con una alta tasa de reconstitución del sistema inmunitario. Sin embargo, ensayos similares fueron restringidos en los Estados Unidos cuando se informó de la aparición de leucemia en pacientes.^{[cita requerida]} Hasta hoy se conocen cuatro casos de niños franceses y uno británico que han desarrollado leucemia como resultado de mutagénesis por inserción de los vectores retrovirales, y todos menos uno de estos niños respondieron bien al tratamiento convencional contra la leucemia. ^{[cita requerida]} En la actualidad, la terapia génica para tratar SCID continúa siendo exitosa en Estados Unidos, Gran Bretaña, Italia y Japón

ADENOVIRUS

Los adenovirus presentan un genoma de DNA bicatenario, y no integran su genoma cuando infectan a la célula huésped, sino que la molécula de ADN permanece libre en el núcleo celular y se transcribe de forma independiente. Esto supone que el efecto posicional o la mutagénesis por inserción no se dan en estos vectores, lo cual no quiere decir que no tengan otros inconvenientes. Además, debido al hecho de que en su ciclo natural se introducen en el núcleo de la célula, pueden infectar tanto células en división como células quiescentes.

A los vectores de primera generación se les eliminó parte del gen E1, básica para la replicación, y a los de 2ª, se les eliminaron otros genes tempranos en el ciclo del virus. En ambos casos, cuando se realiza una infección con una concentración elevada de virus, se produce la expresión de otros genes que provocan una respuesta inmune considerable.

Por ello, los últimos vectores basados en adenovirus prácticamente han sido desprovistos de la mayor parte de sus genes, con la excepción de las regiones ITR (regiones repetidas de forma invertida), y la zona necesaria para la encapsidación.

VIRUS ADENOASICIADOS(AAV)

Los AAV son virus pequeños con un genoma de ADN monocatenario. Pueden integrarse específicamente en el cromosoma 19 con una alta probabilidad. Sin embargo, el VAA recombinante que se usa como vector y que no contiene ningún gen viral, solo el gen terapéutico, no se integra en el genoma. En su lugar, el genoma vírico recombinante fusiona sus extremos a través del ITR (repeticiones terminales invertidas), apareciendo recombinación de la forma circular y episomal que se predice que pueden ser la causa de la expresión génica a largo plazo.
Las desventajes de los sistemas basados en AAV radican principalmente en la limitación del tamaño de DNA recombinante que podemos usar, que es muy poco, dado el tamaño del virus. También el proceso de producción e infección resultan bastante complejos. No obstante, como se trata de un virus no patógeno en la mayoría de los pacientes tratados no aparecen respuestas inmunes para eliminar el virus ni las células con las que han sido tratados.
Muchos ensayos con VAA están en curso o en preparación, principalmente en el tratamiento de músculos y enfermedades oculares, los dos tejidos donde el virus parece ser particularmente útil^{[cita requerida]}. Sin embargo, se están comenzando a realizar pruebas clínicas, donde vectores basados en el VAA son utilizados para introducir los genes en el cerebro^{[cita requerida]}. Esto es posible porque VAA pueden infectar células que no están en estado de división, tales como las neuronas.

HERPES VIRUS
Los herpesvirus son virus de ADN capaces de establecer latencia en sus células huésped. Son complejos genéticamente hablando, pero para su uso como vectores tienen la ventaja de poder incorporar fragmentos de DNA exógeno de gran tamaño (hasta unas 30 kb). Además, aunque su ciclo lítico lo realizan en el lugar de infección, establecen la latencia en neuronas, las cuales están implicadas en numerosas enfermedades del sistema nervioso, y son por ello dianas de gran interés.
Los vectores herpesvíricos puestos en marcha han usado dos estrategias principales:
- La recombinación homóloga entre el genoma del virus completo y el contenido en un plásmido que llevaba el transgén en la zona que codifica para genes no esenciales en lo que se refiere a replicación e infección.
- El uso de vectores con orígenes de replicación del virus así como las correspondientes secuencias de empaquetamiento, y su introducción en estirpes celulares bien coinfectadas con virus silvestres o bien portadoras del resto de genes del mismo implicados en la encapsidación y replicación, para permitir la formación de partículas virales recombinantes con las que realizar el tratamiento.
No obstante, el uso de vectores basados en el HSV (herpes simplex virus humano), sólo puede llevarse a cabo en pacientes que no hayan sido infectados previamente por él, pues pueden presentar inmunidad.